عملية تشغيل تجربة الوسم المزدوج للتألق المناعي على شرائح تسلق الخلايا

1. في لوحة الثقافة ، انقع الشرائح التي تم تسلقها باستخدام PBS ثلاث مرات لمدة 3 دقائق في كل مرة.

2. أصلح الشرائح بنسبة 4 في المائة لامتصاص العرق لمدة 15 دقيقة ، وانقع الشرائح في برنامج تلفزيوني لمدة 3 مرات ، 3 دقائق في كل مرة.

3. Permeabilize مع 0. 5٪ Triton X -100 (محضر في PBS) لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (بالنسبة للمستضدات المعبر عنها في غشاء الخلية ، تم حذف هذه الخطوة).

4. حجب المصل: اغمر الشرائح في برنامج تلفزيوني لمدة 3 مرات لمدة 3 دقائق في كل مرة ، وجفف برنامج تلفزيوني بورق ماص ، وأضف مصل الماعز العادي (بشرط أن يكون مصدر الجسم المضاد الثانوي هو الماعز) على الشرائح ، وحجبه في درجة حرارة الغرفة من أجل 30 دقيقة.

5. أضف الجسم المضاد الأولي: قم بامتصاص محلول الحجب بورق ماص ، لا تغسل ، أضف كمية كافية من الجسم المضاد الأولي المخفف إلى كل شريحة وضعها في صندوق مبلل ، واحتضانها عند 4 درجات طوال الليل.

6. أضف الجسم المضاد الثانوي الفلوريسنت: اغمر الشرائح في PBST لمدة 3 مرات ، 3 دقائق في كل مرة ، وامتصاص السائل الزائد على الشرائح بورق ماص ، وأضف الجسم المضاد الثانوي الفلوري المخفف بالتنقيط ، واحتضنه عند درجة 20-37 لمدة ساعة واحدة في صندوق مبلل ، انقع في شريحة PBST 3 مرات ، 3 دقائق في كل مرة.

ملاحظة: من إضافة الجسم المضاد الثانوي الفلوريسنت ، يجب تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة في مكان مظلم قدر الإمكان.

7. حجب المصل: امسح السائل بورق ماص ، قم بإسقاط مصل الماعز العادي على الشريحة الزجاجية (بشرط أن يكون مصدر الجسم المضاد الثانوي هو الماعز) ، وحجبه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

8. أضف الجسم المضاد الأولي: قم بامتصاص محلول الحجب بورق ماص ، لا تغسل ، ثم أضف الجسم المضاد الأولي المخفف بالتنقيط ، واحتضنه طوال الليل في صندوق رطب 4 درجات في الظلام بعد إضافة الجسم المضاد الأولي. (ملاحظة: تختلف أنواع الجسم المضاد الأولي الثاني عن أنواع الجسم المضاد الأولي الأول ، مثل الفئران والأرانب)

9. أضف الجسم المضاد الثانوي الفلوريسنت: اغمر الشرائح في PBST لمدة 3 مرات ، 3 دقائق في كل مرة ، وامتصاص السائل الزائد على الشرائح بورق ماص ، وأضف الجسم المضاد الثانوي الفلوري المخفف بالتنقيط ، واحتضنه عند درجة 20-37 لمدة ساعة واحدة في صندوق مبلل ، انقع في شريحة PBST 3 مرات ، 3 دقائق في كل مرة. (ملاحظة: إذا تم تحديد الفلورة الحمراء للكشف عن الجسم المضاد الأول ، فيجب على الثاني تحديد ألوان أخرى من التألق)

10. النوى المضادة: تمت إضافة DAPI بالتنقيط وحضنت في الظلام لمدة 5 دقائق ، وكانت العينات ملطخة ، وتم غسل DAPI الزائد بـ PBST 5min × 4 مرات.

11. جفف السائل الموجود على الشريحة بورق ماص ، وأغلق الشريحة بسائل تركيب يحتوي على مادة تقطير مضادة للفلور ، ولاحظ وجمع الصور تحت مجهر مضان.