1. استعادة الخلايا
بعد إزالة الخلايا المحفوظة بالتبريد من النيتروجين السائل ، تمت إذابتها مع الاهتزاز المستمر في حمام مائي بدرجة 37. انقل الخلايا المذابة إلى أنبوب طرد مركزي ، وأضف وسيط DMEM كامل مُسخَّن مسبقًا عند 37 درجة (منها مصل بقري جنيني حوالي 10 بالمائة) ، ثم انفخ بلطف بالتساوي ، وطرد مركزي عند 500 جم لمدة دقيقتين ، وتجاهل المادة الطافية.
أضف وسط DMEM الكامل لغسل وتجاهل المادة طافية. أضف وسطًا كاملًا من DMEM ، واخلطه بلطف عن طريق الأنابيب ، وقم بعمل تعليق خلية ، وقم بتلقيحها في طبق / قارورة بتري ، وثقافة في حاضنة خلية تحتوي على 5 بالمائة من ثاني أكسيد الكربون.
2. مرور الخلية
عندما تصل كثافة الخلية إلى 80 في المائة ~ 90 في المائة (العائد السابق لأوانه غير كاف ، والخلايا المتأخرة في حالة سيئة ، ثقافة فرعية بنسبة 1: 2 إلى 1:10 أو أكثر ، بشكل عام 1: 3 إلى 1: 5 توليد الخلايا ، أي من تلقيح الخلية في وقت الفصل وإعادة الزراعة ، تمت إزالة الوسيط الكامل وغسله مرتين باستخدام 1X PBS.
أضف التربسين (ملاحظة: كمية محلول الهضم هي الأفضل لتغطية الخلايا ، ودرجة حرارة الهضم المثلى هي 37 درجة. راقب الخلايا تحت المجهر: راقب الخلايا المهضومة تحت مجهر مقلوب ، إذا تم سحب السيتوبلازم ، فإن الخلايا لم تعد متصلة ببعضها البعض. شرائح ، تشير إلى أن الخلايا قد تم هضمها بشكل صحيح في هذا الوقت) ، هضمها ، وضعها في حاضنة خلية لمدة 2-3 دقيقة تقريبًا.
أضف كمية مناسبة من وسيط DMEM الكامل لإيقاف التربسين ، ونقله إلى أنبوب الطرد المركزي والطرد المركزي عند 500 جم لمدة دقيقتين ، وتجاهل المادة الطافية ، وإضافة وسيط DMEM الكامل لغسله ، وتجاهل المادة الطافية.
أضف وسيط DMEM الكامل ، واخلطه عن طريق الماصات بلطف ، و 10 ميكرولتر من الماصة للعد ، ثم استمر في الثقافة في حاضنة خلية تحتوي على 5 بالمائة من ثاني أكسيد الكربون وفقًا لحجم الخلية المطلوب.
3. تجميد الخلايا
عندما تصل كثافة الخلية إلى 80 بالمائة ~ 90 بالمائة ، قم بإزالة الوسيط الكامل واغسل مرتين باستخدام 1X PBS. أضف التربسين للهضم وضعه في حاضنة الخلية لمدة 2-3 دقيقة. أضف وسيط DMEM الكامل لإيقاف هضم التربسين ، ونقله إلى أنبوب الطرد المركزي والطرد المركزي عند 500 جم لمدة دقيقتين ، وتجاهل المادة الطافية ، وأضف وسيط DMEM الكامل للغسيل ، وتجاهل المادة الطافية. أضف 1 مل من محلول التجميد (90 بالمائة من مصل بقري جنيني ، 10 بالمائة DMSO. بشكل عام ، يمكن تعديل محتوى المصل بين 10 بالمائة و 90 بالمائة. إضافة مصل إلى محلول التجميد يمكن أن يوفر العناصر الغذائية للخلايا من ناحية ، ويمكن توفير مواد واقية غير منفذة أثناء حفظ الخلايا بالتبريد ، مثل السكروز والألبومين وما إلى ذلك لحماية الخلايا بشكل أفضل) ، ووضعها في أنبوب الحفظ بالتبريد (يوجد كحول أيزوبروبيل في الأنبوب لضمان سرعة خفض درجة الحرارة) ، ضعه على الفور ضعه في الثلاجة ذات الأربع درجات لمدة 30 دقيقة ، ثم ضعه في ثلاجة بدرجة -20 لمدة 30 دقيقة ، ثم ضعه في الثلاجة -80 طوال الليل.
ضعه في النيتروجين السائل في اليوم التالي ، ويمكن تخزينه لمدة عامين على الأقل ، وإذا لم تضعه في النيتروجين السائل ، فيمكن تخزينه لمدة ثلاثة أشهر.
مبدأ حفظ الخلايا بالتبريد واستعادتها هو: التجميد البطيء والذوبان ، وهو أكثر ملاءمة للحفاظ على بقاء الخلية. سيؤدي الحفظ بالتبريد للخلايا دون أي عامل وقائي إلى إنتاج بلورات الجليد داخل الخلايا ، والتي ستسبب أضرارًا ميكانيكية داخلية للخلايا ، وتسبب تغيرات في الضغط التناضحي داخل الخلايا ، ودرجة الحموضة ، والكهارل ، وما إلى ذلك ، ومن ثم تعزيز موت الخلايا.
4. المسائل التي تحتاج إلى الاهتمام
(1) التسخين المسبق لمحلول الاستزراع: ضع الزجاجة المحضرة التي تحتوي على محلول الثقافة ، PBS و trypsin في حمام مائي 37 درجة للتسخين المسبق ؛
(2) استخدم 75 في المائة من الكحول لمسح طاولة العمل فائقة النظافة والأيدي التي تعرضت للإشعاع بالأشعة فوق البنفسجية ؛
(3) التنسيب الصحيح للأدوات المستخدمة: ضمان مساحة تشغيل كافية ، ليس من السهل تشغيلها فحسب ، بل إنها تقلل أيضًا من التلوث ؛
(4) إضاءة مصباح الكحول: لاحظ أن اللهب لا ينبغي أن يكون صغيرًا جدًا ؛
(5) عملية معقمة صارمة ؛
(6) الهضم المعتدل للخلايا الملتصقة: يتأثر وقت الهضم بالعديد من العوامل مثل نوع محلول الهضم ووقت التحضير والكمية المضافة إلى دورق الثقافة. أثناء عملية الهضم ، يجب الانتباه إلى التغيرات في شكل الخلايا المستنبتة. بمجرد تقلص السيتوبلازم ، إذا أصبح الاتصال مفكوكًا ، أو كانت هناك علامات على الطفو في القطع ، يجب إنهاء عملية الهضم على الفور ؛
(7) يجب أن تكون جميع العمليات على الخلايا المارة قريبة من لهب مصباح كحول قدر الإمكان. من الأفضل العمل مع خلية واحدة فقط في كل مرة ، باستخدام مجموعة واحدة من المعدات لكل خلية. تجنب العدوى المتصالبة
(8) يجب تعقيم فم الزجاجة للخلية المارة على مصباح كحول في كل مرة يتم فتحها أو غلقها.
