عندما تخرجت للتو ودخلت الوظيفة ، فأنت تواجه مجموعة من الأسماء التي تواجه تجارب PCR الكمية في الوقت الفعلي. هل أنت محتار حول من أين تبدأ؟ ما معنى منحنى التضخيم والمنحنى القياسي والعتبة وقيمة CT ومنحنى الانصهار وخط الأساس؟ الصور الفلورية من تلك التجارب ساطعة للغاية ، لكن لا يمكنني التعرف عليها. اليوم ، سوف نأخذك لتعلم هذه المعرفة والمفاهيم في جزأين: المصطلحات الفنية والأسئلة المتداولة.
الجزء الأول الشروط المهنية
1. منحنى التضخيم
يشير منحنى التضخيم إلى المنحنى حيث يكون رقم الدورة هو الحد الأقصى وشدة التألق في الوقت الحقيقي أثناء التفاعل هي التنسيق أثناء PCR.
2. خط الأساس
يشير خط الأساس إلى تغيير طفيف في إشارة الفلورسنت خلال الدورات القليلة الأولى من تفاعل تضخيم PCR. يظهر مستوى الإشارة بالقرب من خط مستقيم ، وهو خط الأساس.
3. إعداد عتبة الإسفار
عادةً ، يتم استخدام إشارة التألق لأول 15 دورة من تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل كإشارة خلفية مضان ، وعتبة التألق هي 10 أضعاف الانحراف المعياري لإشارة التألق خلال 3-15 دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وعتبة التألق تم ضبطه خلال المرحلة الأسية لتضخيم PCR. عادةً ما يكون لكل أداة حد التألق الخاص بها قبل الاستخدام.
4. قيمة CT
تمثل قيمة CT عدد الدورات التي ستحدث لكل أنبوب تفاعل PCR عندما تصل إشارة الفلورسنت إلى العتبة المحددة. من البحث ، نعلم أن هناك علاقة خطية بين قيمة CT لكل قالب ولوغاريتم رقم نسخة البداية لهذا القالب. كلما زاد رقم النسخة الأولية ، قلت قيمة CT والعكس صحيح. باستخدام المعايير مع أرقام نسخ البداية المعروفة ، يمكن عمل منحنى معايرة حيث يمثل الإحداثي لوغاريتم رقم نسخة البداية ، بينما يمثل الإحداثي قيمة CT. لذلك ، طالما تم الحصول على قيمة CT للعينة غير المعروفة ، يمكن حساب رقم النسخة الأولية للعينة من المنحنى القياسي.
تعرف أكثر
هناك عدة مؤشرات للحكم على ما إذا كان منحنى التضخيم جيدًا أم لا:
الإجابة: نقطة انعطاف المنحنى واضحة ، وخاصة المرحلة الأسية لعينة الكسر المنخفض الثقيل واضحة ، والتوازي الكلي لمنحنى التضخيم جيد جدًا ، وخط الأساس مسطح ، ولا توجد ظاهرة متصاعدة ، والتضخيم منحنى عينة تركيز الطور الأسي منخفض المستوى جيد جدًا. بديهي.
ب: يتناسب ميل المرحلة الأسية للمنحنى بشكل مباشر مع كفاءة التضخيم ، فكلما زاد المنحدر ، زادت كفاءة التضخيم.
ج: خط الأساس القياسي مسطح أو متناقص قليلاً ، مع عدم وجود اتجاه تصاعدي واضح.
د: إن توازي منحنيات التضخيم لكل أنبوب جيد ، مما يشير إلى أن كفاءة التضخيم لكل أنبوب تفاعل متشابهة.
5. منحنى الانصهار
عندما يتم تسخين منتج PCR ، مع ارتفاع درجة الحرارة ، ينفصل منتج التضخيم المزدوج الشريطة تدريجيًا ، مما يؤدي إلى انخفاض في كثافة التألق. عند الوصول إلى درجة حرارة معينة ، تنفصل كمية كبيرة من المنتج ، مما يؤدي إلى انخفاض حاد في التألق. يختلف استخدام هذه الوظيفة مع قيم TM المختلفة لمنتجات PCR المختلفة أيضًا في درجة الحرارة التي تنخفض فيها إشارة الفلورسنت بسرعة ، والتي قد تكون طريقة جيدة لتحديد خصوصية PCR.
6. منحنى الذوبان (باستخدام المنحنى اللوغاريتمي)
يتكون الرسم البياني للذروة من لوغاريتم منحنى الذوبان لعرض حالة أجزاء المنتج بشكل حدسي. نظرًا لأن درجة حرارة الانصهار هي قيمة TM لجزء من الحمض النووي ، يمكن تحديد بعض المعلمات التي تؤثر على قيمة TM لجزء الحمض النووي ، مثل حجم الجزء ، ومحتوى GC ، وما إلى ذلك بشكل عام ، وفقًا لمبدأ التصميم التمهيدي لدينا ، يُقال عادةً أن يكون طول المنتج المضخم في نطاق 80-300 bp ، ويجب أن تكون درجة حرارة الانصهار بين 80 درجة و 90 درجة.
ج: إذا كانت هناك قمة رئيسية واحدة فقط بين 80 درجة و 90 درجة ، فهذا يعني أن PCR في الوقت الحقيقي مثالي.
ب: إذا ظهرت القمة الرئيسية بين 80 درجة و 90 درجة ، وظهرت ذروة الشوائب أقل من 80 درجة ، فسيتم اعتبار الثنائى التمهيدي أساسًا. يعد هذا خيارًا جيدًا لمحاولة حله عن طريق رفع درجة حرارة التلدين.
ج: إذا ظهرت القمة الرئيسية بين 80 درجة و 90 درجة ، وظهرت ذروة تجول عندما تزداد درجة الحرارة ، يتم النظر في تلوث الحمض النووي بشكل أساسي. ويجب إزالة الحمض النووي في المراحل الأولى من التجربة.
7. خط منحنى قياسي
تم تخفيف المعايير القياسية إلى تركيزات مختلفة واستخدامها كقوالب لتفاعلات PCR. يتم رسم المنحنى القياسي باستخدام لوغاريتم رقم النسخة القياسي باعتباره الإحداثي وقيمة CT المقاسة كإحداثي. عند قياس عينة غير معروفة ، يمكن الحصول على رقم نسخة العينة من المنحنى القياسي بناءً على قيمة CT للعينة غير المعروفة. المنحنيات القياسية مهمة جدا للتقدير الكمي المطلق.
الجزء الثاني. مشكلة شائعة
Q1: ما هو الفرق بين RT-PCR و QPCR و Real-time PCR و RT-PCR في الوقت الحقيقي؟
A1: RT-PCR هو النسخ العكسي لـ PCR ، وهو متغير يستخدم على نطاق واسع لتفاعل البلمرة المتسلسل. في RT-PCR ، يتم نسخ حبلا الحمض النووي الريبي إلى الحمض النووي التكميلي ، والذي يستخدم بعد ذلك كقالب لتضخيم الحمض النووي بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).
في الوقت الحقيقي PCR و QPCR هما نفس الشيء ، كلاهما PCR كمي في الوقت الحقيقي ، مما يعني أن هناك تسجيلًا في الوقت الفعلي للبيانات في كل دورة أثناء عملية PCR. بهذه الطريقة ، يمكن تحليل عدد قوالب بدء التشغيل بدقة.
على الرغم من أن كل من PCR في الوقت الحقيقي والنسخ العكسي PCR يبدو أنهما مختصران على أنهما RT-PCR ، فإن الاتفاقية الدولية هي أن RT-PCR يشير على وجه التحديد إلى النسخ العكسي PCR ، بينما غالبًا ما يتم اختصار PCR في الوقت الحقيقي كـ qPCR (الكمي الحقيقي- True Real-True Real PCR) - الوقت PCR).
في الوقت الحقيقي RT-PCR (RT-QPCR) هو نوع من النسخ العكسي PCR يجمع بين التقنيات الكمية الفلورية: أول نسخ عكسي من RNA للحصول على cDNA (RT) ، متبوعًا بالتحليل الكمي باستخدام PCR في الوقت الحقيقي (QPCR).
س 2: لماذا يتم التحكم في طول جزء المنتج المضخم من تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي الفلوري في نطاق 80-300 bp؟
ج 2: يختلف طول كل تسلسل جيني ، بعضها يبلغ عدة كيلوبايت ومئات من BP. ومع ذلك ، عندما نصمم التمهيدي ، نحتاج فقط إلى أن يكون طول المنتج 80-300 bp ، كما أن الطول القصير جدًا أو الطويل جدًا غير مناسب لاكتشاف PCR الكمي.
شظايا المنتج أقصر من أن يتم تمييزها عن الثنائيات الأولية. يبلغ طول الثنائى التمهيدي حوالي 30-40 bp ، عندما يكون أقل من 80 نقطة أساس ، من الصعب تمييز ما إذا كان عبارة عن مركب تمهيدي أو منتج. إذا كان جزء المنتج طويل جدًا ، ويتجاوز 300 نقطة أساس ، فسيؤدي ذلك بسهولة إلى انخفاض كفاءة التضخيم ، ولا يمكن اكتشاف كمية الجين بشكل فعال.
على سبيل المثال ، عندما تحسب عدد الأشخاص في الفصل الدراسي ، ما عليك سوى حساب عدد الأفواه الموجودة. وينطبق الشيء نفسه عند اختبار الجينات. ما عليك سوى اكتشاف تسلسل معين من الجين لتمثيل التسلسل بأكمله. من السهل أن تخطئ إذا كنت تعد الأفواه والأنوف والأذنين والنظارات لحساب الأشخاص.
Q3: ما هو الطول الأمثل لتصميم التمهيدي؟
ج 3: بشكل عام ، تعتبر أطوال التمهيدي في النطاق 20-24 bp جيدة. بالطبع ، يجب الانتباه إلى قيمة TM للبرايمر عند تصميم البرايمر ، لأنها مرتبطة بدرجة حرارة التلدين المثلى. بعد الكثير من التجارب ، ثبت أن 60 درجة هي قيمة ذاكرة تخزين مؤقت جيدة. يمكن أن تؤدي درجة حرارة التلدين المنخفضة بسهولة إلى تضخيم غير محدد ، بينما تؤدي درجة حرارة التلدين المرتفعة عادةً إلى كفاءة تضخيم منخفضة ، ذروة منحنى التضخيم المتأخر وقيمة التصوير المقطعي المتأخر.
السؤال 4: هل كمية العينة التي تم جمعها تؤثر على نتائج التجربة؟
ج 4: لا ، من الواضح أنه كلما تم جمع المزيد من العينات ، زاد استخراج الحمض النووي الريبي ، زاد عدد cDNA ، وكلما زاد عدد الأجزاء المستهدفة. من أجل التقدير الكمي المطلق ، من الضروري حساب رقم نسخة الجزء المستهدف ، وستؤثر كمية العينة التي تم جمعها بالتأكيد على النتائج التجريبية. على سبيل المثال ، الكشف عن فيروس التهاب الكبد الفيروسي C في الدم هو الكشف عن محتوى HBV بكمية معينة (1 مل) من الدم.
بالنسبة للتقدير الكمي النسبي الذي يشيع استخدامه في البحث العلمي ، فإن عدد العينات لا علاقة له بالنتائج التجريبية ، لأن التقدير الكمي النسبي يشير إلى المقارنة بين الجين المستهدف والجين المرجعي. فقط من فضلك اعتبرهم شظايا في المنبع والمصب موجودة في نفس حبلا الحمض النووي. إذا كان حجم العينة كبيرًا ، تتم زيادة الجينات المرجعية والجينات المستهدفة بنسب متساوية في نفس الوقت ، مما لا يؤثر على النتائج.
س 5: هل ستؤثر كفاءة النسخ العكسي على النتائج التجريبية؟
A5: نفس ما ورد أعلاه. لاحظ أننا نريد كفاءة RT أعلى ، لكننا نفضل أن يكون إنزيم RT مستقرًا نسبيًا ويحصل على نتائج موحدة. سيكون هذا اختبارًا للقدرات المحسّنة لأجنحة النسخ العكسي للشركات الكبرى.
السؤال السادس: هل تؤثر كفاءة انزيم TAQ على نتائج التجربة؟
ج 6: كفاءة إنزيم TAQ كبيرة نسبيًا. عادةً ما تكون إنزيمات taq ذات البدء الساخن مطلوبة وهي فعالة نسبيًا. بالنسبة للمجموعات الكمية الفلورية التجارية ، سيعمل كل مصنع على تحسين كفاءة أفضل حالة وفقًا لمنتجاته الخاصة بالقرب من 100 في المائة ، إذا كانت الكفاءة منخفضة جدًا ، فلا يمكن الحصول على النتائج التجريبية. بالنسبة لمنتجات الشركات المختلفة ، يعد هذا مقياسًا للجودة.
السؤال 7: هل كمية الصبغة الفلورية تؤثر على نتائج التجربة؟
ج 7: نعم ، ستفعل. إذا كان الفلوركروم مشبعًا جدًا ، فقد يتسبب ذلك في حدوث تداخل ضوضاء في بعض الأدوات. إذا لم يكن الفلوركروم مشبعًا ، وكانت قيمة التألق منخفضة جدًا ، فسوف تدخل مرحلة الهضبة مبكرًا وسيكون منحنى التضخيم مسطحًا. في التجربة الكمية الفلورية ، تُرى قيمة التصوير المقطعي المحوسب بشكل أساسي ، لذلك ليس من المهم أن يدخل منحنى التضخيم المتأخر مرحلة الهضبة ، لكن الصورة ليست جميلة بما فيه الكفاية. إذا كان عليك الاختيار ، فابدأ باختيار فلوروكروم أقل تشبعًا بقليل. ومع ذلك ، عند استخدام نفس المنتج من نفس الشركة ، فإن تأثيره لا يكاد يذكر.
السؤال 8: هل سيؤثر انتقال أنبوب PCR على نتائج التجربة؟
ج 8: نعم. ومع ذلك ، بالنسبة لمجموعة المواد الاستهلاكية نفسها من نفس الشركة المصنعة ، يمكن تجاهل هذا التأثير. يعد هذا اختيارًا جيدًا ومن الأفضل استخدام 96- لوحة بئر بغشاء عالي النفاذية لتقليل تأثير نفاذية الضوء للمواد الاستهلاكية.
س 9: هل ستؤثر الأخطاء أثناء العملية على نتائج التجربة؟
ج 9: ينعكس تأثير عملية التشغيل بشكل أساسي في التوحيد. يعني التجانس أن جميع المكونات في النظام يتم خلطها معًا بالتساوي ، ويمكن للطرد المركزي الفلاش حل هذه المشكلة. بالإضافة إلى ذلك ، بالنسبة للمبتدئين ، من الأفضل ضبط نظام PCR ليكون أكثر من 20 بوصة ، والنظام الصغير جدًا يكون أكثر عرضة للأخطاء. إذا تم تحسين درجة حرارة التلدين بشكل صحيح ، يتم تقليل تأثير تركيز التمهيدي على CT. وستعرف أنه يمكن تجنب بعض الأخطاء التشغيلية (مثل تركيز المادة الأولية) عن طريق تحسين درجة حرارة التلدين.
لخص
ما سبق هو بعض الأسئلة والأسئلة التي كثيرًا ما يواجهها المبتدئون أثناء التجربة ، ونأمل أن تساعدك هذه الأسئلة في حل بعض الالتباس. التجريب هو عملية توليد الفوضى وحل المشكلات ، ونأمل أن تحصل على شيء منها. شكرا للقراءة وسنراك في المرة القادمة!
