1 - استعادة
● 1. أخرج القارورة المبردة من النيتروجين السائل ، وضعها على الفور في حمام مائي 37 درجة ، ورجها قليلاً. بعد أن يذوب السائل (حوالي 1-1. 5 دقائق) ، أخرجه ورش القليل من الكحول وضعه على طاولة العمل فائقة النظافة.
● 2. نضح تعليق الخلية أعلاه في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل مملوءًا بوسط 10 مل (اغسل أنبوب الحفظ بالتبريد بمتوسط لغسل جميع الخلايا الملتصقة بالجدار) ، وطرد مركزي عند 1000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
● 3. تخلص من المادة الطافية وأضف 1 مل من الوسط لتعليق الخلايا. يُستنشق في طبق بتري بحجم 10 سم يحتوي على 10 مل من وسط المزرعة ويهتز برفق ذهابًا وإيابًا لجعل الخلايا في طبق بتري موزعة بالتساوي.
● 4. قم بتسمية نوع الخلية والتاريخ ، واسم المزارع ، وما إلى ذلك ، وضعها في حاضنة ثاني أكسيد الكربون للزراعة. بعد أن تلتصق الخلايا بالجدار ، قم بتغيير الوسط.
● 5. قم بتغيير الوسيط كل 3 أيام.
2. المرور
● 1. المرور عندما تصل تغطية الخلية في طبق الثقافة إلى 80 بالمائة -90 بالمائة.
● 2. نضح الوسيط الأصلي.
● 3. أضف التربسين المناسب (يكفي فقط لتغطية الخلايا) ويهضم لمدة 1-2 دقيقة.
● 4. بعد تقريب الخلايا ، أضف حجمًا متساويًا من الوسط المحتوي على المصل لإنهاء الهضم.
● 5. استخدام ماصة لتعليق الخلايا عن طريق الماصات.
● 6. نضح الخلايا في أنبوب الطرد المركزي 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 1000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
● 7. تخلص من المادة الطافية ، أضف 1-2 وسط مل ، ثم انفجر الخلايا.
● 8. انقل الخلايا إلى عدة أطباق حسب نوع الخلية. بشكل عام ، هناك 5 خلايا سرطانية و 3 خلايا طبيعية. استمر في الزراعة.
3. الحفظ بالتبريد هضم الخلايا وأجهزة الطرد المركزي (المرجع نفسه). قم بتعليق الخلايا بمحلول التجميد المحضر ، ووزعها في قوارير مبردة معقمة ، اتركها تقف لبضع دقائق ، وحدد نوع الخلية وتاريخ الحفظ بالتبريد. 4 درجة لمدة 30 دقيقة ، -20 درجة لمدة 30 دقيقة ، -80 درجة بين عشية وضحاها ، ثم وضعها في النيتروجين السائل للتخزين. تحضير محلول الحفظ بالتبريد: 70 بالمائة وسط كامل زائد 20 بالمائة FBS بالإضافة إلى 10 بالمائة DMSO. يجب إضافة DMSO ببطء في اتجاه القطرات ، والاهتزاز أثناء التنقيط.
