تعد زراعة الخلايا من أهم الأدوات المستخدمة في البيولوجيا الخلوية والجزيئية ، حيث توفر نظامًا نموذجيًا ممتازًا لدراسة علم وظائف الأعضاء العادي والكيمياء الحيوية (على سبيل المثال ، دراسات التمثيل الغذائي ، والشيخوخة) ، وتأثير الأدوية والمركبات السامة على الخلايا وكذلك التأثيرات من الطفرات الخلوية والتسرطن. كما أنها تستخدم في فحص الأدوية وتطويرها ، وفي الإنتاج الواسع النطاق للمركبات البيولوجية (مثل اللقاحات والبروتينات العلاجية). تتمثل الميزة الرئيسية لاستخدام زراعة الخلايا لأي من هذه التطبيقات في اتساق النتائج وإمكانية تكرار نتائجها التي يمكن الحصول عليها باستخدام مجموعة من الخلايا المستنسخة.
زراعة الخلايا
تشير ثقافة الخلية إلى إزالة الخلايا من الحيوانات أو النباتات ونموها في بيئة اصطناعية مواتية. يمكن إزالة الخلايا مباشرة من الأنسجة وفصلها إنزيميًا أو ميكانيكيًا قبل الزراعة ، أو يمكن اشتقاقها من سلالات أو سلالات خلوية مثبتة
1. التدريب الابتدائي
تشير الثقافة الأولية إلى مرحلة الاستنبات بعد عزل الخلايا من الأنسجة ونشرها في ظل ظروف مناسبة حتى تشغل كل الركيزة المتاحة (أي تصل إلى نقطة التقاء). في هذه المرحلة ، يجب أن تتم زراعة الخلايا (أي ، المرور) عن طريق نقلها إلى حاوية جديدة ذات وسط نمو جديد لتوفير مساحة أكبر للنمو المستمر.
2. خطوط الخلايا
بعد الثقافة الفرعية الأولى ، تسمى الثقافات الأولية خطوط الخلايا أو النسائل الفرعية. تتمتع سلالات الخلايا المشتقة من الثقافات الأولية بعمر محدود (أي أنها محدودة) وعندما يتم تمريرها ، تسود الخلايا ذات إمكانات النمو الأعلى ، مما يؤدي إلى درجة من التوحيد الوراثي والنمط الظاهري في جنس السكان.
3. خطوط الخلايا
يصبح خط الخلية سلالة خلية إذا تم تحديد مجموعة سكانية فرعية لخط الخلية بنشاط من الثقافة عن طريق الاستنساخ أو طرق أخرى. غالبًا ما تكتسب خطوط الخلايا تغييرات وراثية إضافية بعد بدء الخط الأبوي.
4. خطوط الخلايا المحدودة وخطوط الخلايا المستمرة
عادة ما تنقسم الخلايا الطبيعية عددًا محدودًا من المرات قبل أن تفقد قدرتها على التكاثر ، وهو حدث محدد وراثيًا يسمى الشيخوخة. تسمى خطوط الخلايا هذه محدودة. ومع ذلك ، فإن بعض خطوط الخلايا تصبح خالدة من خلال عملية تسمى التحول ، والتي يمكن أن تحدث تلقائيًا أو يتم تحفيزها كيميائيًا أو فيروسيًا. يصبح خط الخلية المحدود خطًا خلويًا مستمرًا عندما يخضع لعملية تحول ويكتسب القدرة على الانقسام إلى أجل غير مسمى.
خطوط الخلايا المزروعة باستمرار عرضة للانحراف الجيني ، وخطوط الخلايا المحدودة محكوم عليها بالشيخوخة ، وجميع مزارع الخلايا عرضة للتلوث الميكروبي ، ويمكن أن يحدث فشل في المعدات حتى في أفضل المختبرات. نظرًا لأن خطوط الخلايا المنشأة هي مورد قيم يكون استبداله مكلفًا ويستغرق وقتًا طويلاً ، فمن الضروري حفظها بالتبريد لتخزينها على المدى الطويل.
بمجرد الحصول على عدد صغير من الخلايا المتبقية من الثقافة الفرعية ، يجب تجميدها كمخزون بذور وحمايتها من الاستخدام المعملي العام. يمكن تحضير المخزونات العاملة وتجديدها من مخزونات البذور المجمدة. إذا تم استنفاد مخزون البذور ، فيمكن استخدام مخزون العمل المحفوظ بالتبريد كمصدر لإعداد مخزون البذور الطازجة ، مما يؤدي إلى الحد الأدنى من الزيادة في الكمية من التجميد الأولي.
أفضل طريقة لحفظ الخلايا المستنبتة هي في النيتروجين السائل ، في وسط كامل ، في وجود مواد واقية من التجمد مثل ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) أو الجلسرين. تقلل المواد الواقية من البرودة نقطة التجمد للوسط وتقلل أيضًا من معدل التبريد ، مما يقلل بشكل كبير من خطر تكوين بلورات الجليد ، والتي يمكن أن تتلف الخلايا وتؤدي إلى موت الخلايا.
من المعروف أن DMSO يسهل دخول الجزيئات العضوية إلى الأنسجة. عند التعامل مع الكواشف المحتوية على ثنائي ميثيل سلفوكسيد ، يجب استخدام المعدات والممارسات المناسبة لمخاطر هذه المادة. تخلص من الكواشف وفقًا للوائح المحلية.
تنمو الخلايا من مخزون الخلايا العاملة المجمدة
تأكد من ملء سجل الخدمات المصرفية عبر الهاتف المحمول
حدد عدد الممرات ، على سبيل المثال ، إذا تم تجميد الخلايا السابقة وتم إذابتها ثلاث مرات ، فستكون عملية الذوبان هي المقطع الرابع.
أضف وسائط النمو (الحد الأدنى من الوسائط ومصل العجل والمضادات الحيوية) إلى قوارير T75 المسمى بخط الخلية ورقم المرور والتاريخ
ضع القارورة أفقياً في حاضنة CO عند 37 درجة و 5 بالمائة CO لمدة 15 دقيقة على الأقل. سيؤدي هذا إلى تدفئة الوسط وإعادته إلى درجة الحموضة الطبيعية (7. 0-7. 6)
قم بإذابة القوارير المجمدة بخطوط الخلايا في حمام مائي بدرجة 37 درجة مع تحريك لطيف. لتقليل خطر التلوث ، حافظ على الحلقة والغطاء فوق مستوى الماء (2-5 دقيقة).
ضع القارورة في خزانة أمان بيولوجية (BSL -2). لتجنب التلوث ، امسح باستخدام 70٪ من الإيثانول قبل فتح القارورة.
نقل محتويات قارورة الخلية المجمدة إلى قارورة T75 تحتوي على وسط النمو. امزج ورج القارورة برفق لتوزيع الخلايا بالتساوي على سطح القارورة.
احتضان القارورة بين عشية وضحاها في حاضنة CO2 عند 37 درجة مع 5 في المئة من ثاني أكسيد الكربون. السماح للخلايا بإرفاقها بين عشية وضحاها
متوسط النمو المتغير
احتضان القارورة لمدة 2-4 أيام إضافية عند 37 درجة ، و 5 بالمائة من ثاني أكسيد الكربون ، وراقب حتى تنمو الخلايا
بمجرد أن تصل الخلايا إلى التقاء 90 بالمائة تقريبًا ، يمكن توسيع مخزون الخلايا باستخدام قارورة T150
